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更新时间:2019-08-22 17:23:29
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ELISA
实验注意事项
1.
正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或
BSA
等封闭。
2.
在
ELISA
中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括
:
(1)
固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是
40
孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。
(
2)
包被抗体
(
或抗原
)
的选择:将抗体
(
或抗原
)
吸附在固相载体表面时,要求纯度要好
,
吸附时一般要求
PH
在
9.0
~
9.6
之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响
,
一般多采用
4
℃
18
~
24
小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度
(0.1
、
1.0
和
10
μ
g
/
ml
等
)
进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的
OD
值。选择
OD
值
zui大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为
1
~
10
μ
g
/
ml
。
(3)
酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接
ELISA
法进行初步效价的滴定
(
见酶标记抗体部份
)
。然后再固定其它条件或采取
“
方阵法
”
(
包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度
)
在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4)
酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应,而本身无色。有些供氢体
(
如
OPD
等
)
有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如
TMB
和
ABTS
是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以
10-30
分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制,尤其是
H2O2
在临用前加入。